LA DETECCIÓN DEL BIOFILM Y LAS AMEBAS COMO INDICADOR PRECOZ DE LEGIONELLA EN LAS TORRES DE REFRIGERACIÓN

Las torres de refrigeración son dispositivos que sirven para un enfriamiento rentable y energéticamente eficiente en una amplia gama de sistemas y procesos, como la generación de energía, las industrias petroquímicas, la climatización comercial o en la industria alimentaria, entre otros.

 

Como aparatos de intercambio de calor, hacen circular el agua de los procesos industriales a temperaturas elevadas frente a un flujo de aire en dirección opuesta o perpendicular al agua, promoviendo la transferencia de calor y ocasionando pérdida de calor por evaporación.

 

El agua enfriada se recoge en una balsa, para ser recirculada dentro del sistema o desechada como aguas residuales. El material de relleno, habitualmente hecho de cloruro de polivinilo (PVC) es transcendental para estos sistemas, ya que proporciona una amplia superficie, aumentando el tiempo de contacto entre el agua y el aire, mejorando la eficiencia del equipo. 

 

Los biofilms son comunidades microbianas complejas cubiertas por una matriz extracelular de polímeros polisacáridos (EPS), ADN y proteínas que se desarrollan perfectamente en el PVC del relleno y representan un significativo reservorio microbiano, especialmente de algas y bacterias.

 

En este microecosistema, se dan las condiciones ideales para el crecimiento microbiológico, como son la gran superficie de contacto con el agua, la baja velocidad del flujo de agua y la temperatura templada que se encuentra en las torres de refrigeración y que contribuyen en gran medida a la formación de esta capa biológica.

 

Los EPS protegen las bacterias de las condiciones ambientales y los tratamientos de desinfección, por lo que el biofilm es capaz de resistir a los desinfectantes permitiendo que las bacterias patógenas puedan persistir y multiplicarse fácilmente en este ambiente.

 

En las superficies de los equipos y conducciones, los biofilms contienen muchas más células microbianas totales que en el agua circulante (fase planctónica). La gran superficie del relleno en una torre de refrigeración facilita la formación de biofilm con las condiciones ideales para el crecimiento de Legionella. Por ello, las torres de refrigeración son fuente de una gran parte de los brotes de enfermedad del legionario, especialmente aquellos que causan una importante cantidad de enfermos.

 

Además, el biofilm que cubre rápidamente cualquier superficie en contacto con el agua puede causar corrosión inducida por microbios o biocorrosión, lo que puede reducir el rendimiento, aumentar el consumo de energía y disminuir el intercambio de calor, generando una menor eficiencia del equipo.

 

Un punto crítico en el análisis de detección de Legionella es no tener en cuenta el entorno ecológico de los biofilms, que son cruciales para la supervivencia y proliferación de Legionella en las instalaciones acuáticas. Sin embargo, el biofilm de las torres de refrigeración en general sigue en gran medida sin estudiar y sin utilizar como fuente de muestreo y control de la colonización de Legionella, especialmente en el material del relleno.

 

Hay una evidencia confirmada en numerosos estudios sobre la relación entre la persistencia de Legionella y las especies de protozoos y amebas de vida libre, como Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris, Naegleria fowleri, Paravahlkampfia sp. o Vermamoeba vermiformis.

 

Una de las funciones más problemáticas del biofilm respecto a Legionella es que atrae a las amebas de vida libre para nutrirse de la abundante fuente de alimento que supone la gran concentración de microorganismos de este biofilm. En este ambiente, la Legionella utiliza las amebas para replicarse en su interior, aunque también puede obtener nutrientes directamente de otros microorganismos vivos y a través de la alimentación necrotrófica de células microbianas en descomposición, que son casi el 50% de un biofilm.

 

Sorprendentemente, la Legionella logra resistir la digestión de las amebas y permite su replicación. Sin embargo, las complejas relaciones entre Legionella, biofilms y protozoos a menudo se pasan por alto, sin ningún método de muestreo estandarizado que controle los riesgos en las torres de refrigeración.

 

Esta variada simbiosis entre las amebas y la Legionella, le permite su proliferación, confiere protección frente a los elementos externos y aboca la Legionella al agua circulante a modo de “caballo de Troya”. Por ello, conocer la dinámica vital de las amebas en el biofilm puede ser un indicador que alerte de forma temprana del riesgo de la instalación por una mayor presencia de Legionella en el agua.

 

El control de la proliferación de Legionella en los circuitos de agua de las torres de refrigeración requiere un muestreo periódico y procedimientos de mantenimiento y limpieza y desinfección efectivos. La detección de Legionella generalmente se basa en el cultivo y con menos frecuencia con el análisis rápido con la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) o el Número Más Probable (NMP).

 

Desgraciadamente, estos métodos tienen algunos inconvenientes importantes. Son técnicas que solo detectan las bacterias circulantes en el agua y que tan solo representan el 10% del total; el otro 90% de las bacterias viven unidas al biofilm.

 

De otro lado, la qPCR puede aportar falsos positivos en ocasiones por detección cruzada de material genético de otras bacterias y el NMP sólo detecta Legionella pneumophila y precisa de al menos siete días para obtener los resultados.

 

Además, la detección de Legionella por cultivo precisa de un tiempo prolongado para obtener resultados entre 10-14 días y presenta una recuperación muy baja de las bacterias presentes en el agua. 

 

Esto sucede porque, además de la eficacia limitada del cultivo, una parte importante de la población microbiana, generalmente conocida como viable pero no cultivable (VBNC), ha perdido su capacidad para formar colonias en las placas de cultivo en condiciones de estrés, aunque estas bacterias todavía pueden estar activas y causar enfermos de Legionella.

 

Estas limitaciones de cultivo están relacionadas principalmente con los siguientes problemas:

 

·      La cultivabilidad de Legionella se ve afectada por la naturaleza exigente del crecimiento de las bacterias.

·      La presencia de otras bacterias que colonizan la muestra de agua puede generar competencia y mermar la capacidad de Legionella para crecer en el medio de laboratorio.

·      Las células de Legionella VBNC o de Legionella dentro de las vesículas no se detectan.

·      Los tiempos entre la recolección de muestras y el procesado pueden causar pérdida de cultivabilidad.

 

De ese modo, los brotes y casos esporádicos pueden continuar apareciendo a pesar del cumplimiento de los protocolos de análisis y normas de prevención suponiendo un riesgo persistente para la salud pública. No obstante, en determinadas ocasiones también es recomendable utilizar la qPCR para detectar Legionella más rápidamente, con mayor sensibilidad y con tiempos de respuesta más rápidos para prevenir la proliferación bacteriana y los posibles casos y brotes de enfermedad.

 

Sin embargo, en España mediante el Real Decreto 487/2022, por el que se establecen los requisitos sanitarios para la prevención y el control de la legionelosis y en otros muchos países, se mantiene la obligación de utilizar siempre el cultivo como método de referencia para la detección de Legionella spp. utilizando el protocolo de la norma UNE-EN ISO 11731:2017 Calidad del agua. Recuento de Legionella y solo se acepta utilizar otras técnicas como la qPCR de forma complementaria en situaciones como:

 

a.        En investigación de riesgo para la salud de la población.

b.        En investigación de la aparición de casos.

c.        En investigación de la aparición de un brote.

d.        Cuando la autoridad sanitaria lo considere necesario.

e.        Cuando los equipos presentan un funcionamiento irregular o múltiples paradas, y puestas en marcha en periodos de tiempo cortos, sin menoscabo de la realización de los correspondientes cultivos.

 

No obstante, el conocimiento adquirido durante décadas sobre los resultados del cultivo y el riesgo de Legionella en las instalaciones le mantiene como una herramienta valiosa en las estrategias de prevención y control en las instalaciones de riesgo.

 

Es evidente que la gestión eficaz frente a Legionella en las torres de refrigeración debe ser un proceso integrado, adaptable a los cambios y basado en información crucial sobre los problemas del tratamiento del agua y de la instalación. Este proceso se podría describir como "estar atento a todo el panorama", en vez de "centrarse sólo en una pieza aislada del rompecabezas".

Como se ha descrito, es una evidencia más que una hipótesis que el muestreo para detección de biofilms y amebas en las torres de refrigeración podría servir como un "indicador principal" más fiable y precoz que el análisis convencional de Legionella en el agua circulante.

 

Dado el papel de los protozoos en la ecología y virulencia de Legionella, parece que es clave incluir su análisis en los protocolos de muestreo pues la detección de amebas de vida libre puede ser útil para predecir la "alta posibilidad de aparición inminente de Legionella" en instalaciones como las torres de refrigeración. Sin embargo, los protozoos no se detectan mediante los métodos bacteriológicos tradicionales y la búsqueda de la gran diversidad de amebas de vida libre puede ser una tarea difícil, costosa y laboriosa.

 

Dada esa gran diversidad y habiéndose demostrado que Vermamoeba y Acanthamoeba son los huéspedes predominantemente asociados con L. pneumophila, se plantea la posibilidad de seleccionar indicadores específicos de estos dos protozoos que podrían estar vinculados a la presencia de Legionella.

 

Los métodos de detección principalmente utilizados son:

 

·      el co-cultivo de amebas y Legionella

·      las técnicas moleculares como la PCR

·      la técnica de FISH (Hibridación Fluorescente In Situ) que es una herramienta de biología molecular que utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia e identifica especies concretas de amebas directamente en muestras ambientales mediante microscopía de fluorescencia.

 

Para muestrear y estudiar el biofilm, se utilizan diferentes métodos:

 

1. Muestreos con torunda mediante un hisopo estéril directamente sobre las superficies interiores de tuberías, acumuladores o fondos de torres de refrigeración para recoger el biofilm adherido. De forma rutinaria, este análisis sirve para la detección de Legionella, pero no para buscar la presencia de amebas. Según el Real Decreto 487/2022, esta toma de muestras para análisis de Legionella se realizará cuando se requiera un mayor conocimiento de la contaminación por Legionella de la instalación. En particular, se debe analizar biofilm cuando:

·      La investigación tras la declaración de casos/brotes que pudieran estar asociados con la instalación.

·      Se pretenda comprobar la eficacia de los tratamientos de limpieza y desinfección de choque.

·      Lo considere oportuno el responsable técnico en función de la finalidad perseguida, en la investigación de instalaciones con presencia recurrente de Legionella, la detección previa de Legionella en instalaciones prioritarias, la realización del diagnóstico inicial, etc.

·      Lo determine la autoridad sanitaria.

 

2. La medida de ATP (Trifosfato de Adenosina) mediante bioluminiscencia es un método que permite estimar la presencia de materia orgánica y microorganismos. Aunque no identifica bacterias específicas ni mide el conteo total de células, sirve como un excelente indicador de alerta temprana para detectar y prevenir la formación de biofilms en superficies. Los datos cuantitativos de la medición de ATP se obtienen indirectamente, es decir, se calcula la cantidad de células de forma proporcional a la intensidad de fluorescencia medida. Este método se aplica para todo tipo de microorganismos, por lo que puede conducir a una gran inexactitud en su interpretación. 

 

3. La citometría de flujo es una técnica alternativa que permite la caracterización cualitativa y cuantitativa de las células suspendidas en un líquido. Se utilizan sensores o testigos que se sitúan generalmente en un by-pass de la conducción principal del agua y que posteriormente, se recuperan y se analizan periódicamente Además de la cuantificación rápida, la citometría de flujo puede proporcionar información sobre el estado fisiológico de las células (total frente a viable). 

 

4. Cupones o testigos de biofilm para Legionella que son pequeñas piezas de material plástico o acero inoxidable que se instalan en los sistemas de agua como torres de refrigeración o redes de agua para evaluar el crecimiento real de biofilms, midiendo el riesgo de proliferación de la bacteria antes de que esta se libere al agua.

 

5. Biosensores en continuo con sistemas IoT para la detección temprana del crecimiento microbiológico en las redes hidráulicas, proporcionando una lectura directa del porcentaje de superficie colonizada. En ocasiones, se puede utilizar las herramientas de IA para obtener los resultados y mide, registra y analiza de forma continua variables críticas como temperatura, potencial redox (ORP), conductividad o presión.

 

Algunas de estas técnicas todavía no se encuentran disponibles de forma fácil en el sector de laboratorios o tecnología de España y, por tanto, se deben plantear como métodos a utilizar en situaciones e instalaciones concretas. En la actualidad, existe, por tanto, una enorme brecha entre la importancia del control de biofilms y las amebas y la aplicación de estos métodos en las tareas diarias y reales de las torres de refrigeración y de otras instalaciones.

 

Un reciente estudio de diferentes centros británicos ha encontrado que los biofilms son indicadores críticos para la detección temprana y fiable de Legionella pues la bacteria se detectó más persistentemente en muestras de biofilm que en muestras de agua. Además, la detección de concentraciones elevadas en el biofilm precede o coincide con picos en las detecciones de Legionella en el agua circulante.

 

Para ello, se cuantificaron las concentraciones de biofilm y células planctónicas, la viabilidad y la presencia de Legionella y los datos fisicoquímicos de las torres de refrigeración. Legionella pneumophila se detectó exclusivamente en biofilms, mientras que las concentraciones de Legionella spp. se detectaron con más frecuencia en biofilms que en el agua, con crecimientos en los biofilms que a menudo preceden a elevaciones de la bacteria en el agua.

 

En la investigación, las muestras de biofilm y de agua revelaron una dinámica microbiana distinta, sin correlación entre los recuentos totales de bacterias o la viabilidad celular y la presencia de Legionella. Este hecho subraya que la carga microbiana por sí sola es insuficiente para predecir el riesgo de Legionella y destaca la necesidad de enfoques más amplios de control que tengan en cuenta otros factores ambientales relevantes. 

 

Al demostrar que el cultivo del agua puede subestimar la presencia de Legionella y, por lo tanto, el riesgo potencial de legionelosis, este estudio concluye que el muestreo de biofilms es una importante herramienta para mejorar la sensibilidad, precisión y eficacia de la detección de Legionella en el control ambiental y la protección de la salud pública. Así, se demuestra el valor de incorporar las evaluaciones basadas en biofilms en las estrategias de vigilancia y control de la Legionella en las torres de refrigeración.

 

 

Real Decreto 487/2022, de 21 de junio, por el que se establecen los requisitos sanitarios para la prevención y el control de la legionelosis.

 

Pereira, A.; Silva, A.R.; Melo, L.F. Legionella and Biofilms—Integrated Surveillance to Bridge Science and Real-Field Demands. Microorganisms 2021, 9, 1212. https://doi.org/10.3390/microorganisms9061212

 

Thiago dos Santos Gomes. Tesis doctoral. Interacción entre acanthamoeba y legionella en el medio ambiente: implicación en salud humana. https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=180913

 

Campaña, M., Del Hoyo, R., Monleón-Getino, A. and Checa, J., Predicting Legionella contamination in cooling towers and evaporative condensers from microbiological and physicochemical parameters, Int. J. Hyg. Environ. Health, 2023, 248, 114117

 

Di Pippo, F., Di Gregorio, L., Congestri, R., Tandoi, V. and Rossetti, S., Biofilm growth and control in cooling water industrial systems, FEMS Microbiol. Ecol., 2018, 94(5), fiy044.

 

Ana Rosa Silva, C. William Keevil, Ana Pereira, Legionella affects biofilm structural response to detachment upon shear stress increase, Biofilm, Volume 10, 2025, 100323, ISSN 2590-2075, https://doi.org/10.1016/j.bioflm.2025.100323

 

Ortlieb C, Labrosse A, Ruess L, Steinert M. Biotic interactions between the human pathogen Legionella pneumophila and nematode grazers in cooling tower biofilms. PLoS One. 2024 Oct 25;19(10):e0309820. doi: 10.1371/journal.pone.0309820

 

Valciņa O, Pūle D, Mališevs A, Trofimova J, Makarova S, Konvisers G, Bērziņš A, Krūmiņa A. Co-Occurrence of Free-Living Amoeba and Legionella in Drinking Water Supply Systems. Medicina (Kaunas). 2019 Aug 15;55(8):492. doi: 10.3390/medicina55080492.

 

Winiecka-Krusnell J, Linder E. Free-living amoebae protecting Legionella in water: the tip of an iceberg ? Scand J Infect Dis. 1999;31(4):383-5. doi: 10.1080/00365549950163833.

 

Ute Scheikl, Regina Sommer, Alexander Kirschner, Alexandra Rameder, Barbara Schrammel, Irene Zweimüller, Wolfgang Wesner, Manfred Hinker, Julia Walochnik, Free-living amoebae (FLA) co-occurring with legionellae in industrial waters, European Journal of Protistology, Volume 50, Issue 4, 2014, Pages 422-429, ISSN 0932-4739, https://doi.org/10.1016/j.ejop.2014.04.002.

 

Logan-Jackson, A.; Rose, J.B. Cooccurrence of Five Pathogenic Legionella spp. and Two Free-Living Amoebae Species in a Complete Drinking Water System and Cooling Towers. Pathogens 2021, 10, 1407 1407. https://doi.org/10.3390/pathogens10111407

 

Abu Khweek A and Amer AO (2018) Factors Mediating Environmental Biofilm Formation by Legionella pneumophila. Front. Cell. Infect. Microbiol. 8:38. doi: 10.3389/fcimb.2018.00038