COMPARACIÓN ENTRE CULTIVO, LEGIOLERT Y qPCR PARA LEGIONELLA PNEUMOPHILA EN AGUA POTABLE

La Directiva Europea 2020/2184 relativa a la calidad del agua para el consumo humano ahora incluye Legionella entre los patógenos que deben analizarse en las redes de agua domésticas. 

 

La norma europea establece que el método de análisis para el cumplimiento del valor establecido en el anexo I, parte D de la Directiva para Legionella es EN ISO 11731. El valor paramétrico para Legionella es < 1000 ufc/L.

 

Sin embargo, para el control de la verificación basada en riesgos y para complementar los métodos de cultivo, en métodos de adición, como el de ISO/TS 12869, pueden utilizarse métodos rápidos de cultivo, métodos no basados en el cultivo y métodos moleculares, en particular la PCR en directo (qPCR).

 

Ahora se ha publicado un estudio multicéntrico realizado en Italia para analizar muestras de agua potable comparando tres diferentes métodos de detección de Legionella pneumophila:

 

·      Método estándar de cultivo de placa 

·      Método de PCR en tiempo real DI-Check Legionella pneumophila (Diatheva) 

·      Método de cultivo líquido Legiolert (IDEXX) 

 

El objetivo del estudio era determinar qué técnicas complementarían mejor el método de cultivo de placa.

 

Para ello, se examinaron muestras de agua de varias fuentes, obtenidas de los análisis habituales del laboratorio y también se investigó el uso de placas de agar de extracto de levadura de carbón tamponada (BCYE) no selectivas de acuerdo con ISO 11731:2017. 

 

Además, para mejorar la aplicación de la PCR en tiempo real para la detección de Legionella en muestras ambientales, se evaluaron protocolos alternativos de extracción de ADN utilizando volúmenes de agua reducidos.

 

En este estudio, 33 laboratorios de toda Italia analizaron una serie de muestras de agua únicas que iban de 10 a 30 para la presencia de Legionella pneumophila.

 

Todos los laboratorios utilizaron el método estándar de cultivo de placa, 31 laboratorios también realizaron el método de cultivo líquido rápido Legiolert (Laboratorios IDEXX) y 27 de 33 realizaron el método de PCR en tiempo real DI-Check Legionella pneumophila (Diatheva). En total, 23 laboratorios ejecutaron los tres métodos.

 

Se analizaron 817 muestras de agua potable por cultivo de placa en medios BCYE y GVPC y el 54,6% (n = 446) fueron positivos. L. pneumophila fue la especie predominante (88%), mientras que solo el 12 % (54 de las 446) de muestras de agua positivas tenían Legionella no pneumophila.

 

Los datos obtenidos del análisis de muestras de agua potable con el método de cultivo de placa utilizando tanto el extracto de levadura de carbón tamponada (BCYE) no selectivas como los medios no selectivos de glicina vancomicina polimixina cicloheximida (GVPC) mostraron la mayor capacidad de este último en la recuperación de Legionella.

 

De las 817 muestras de agua analizadas por cultivo, muchas también se analizaron utilizando Legiolert 100 ml (717 muestras) y Legiolert 10 ml (272 muestras). 

 

Del mismo modo, una comparación de las muestras analizadas tanto por la prueba de Legiolert de 100 ml como por la prueba de Legiolert de 10 ml. indica una muy buena concordancia dentro de estos métodos. 

 

El método Legiolert permitió el análisis con un volumen de muestra más pequeño (100 ml y 10 ml), en comparación con el método de cultivo estándar con el que se demostró que era comparable en los dos volúmenes mencionados, respectivamente.

 

El uso de Legiolert acortaría tanto el tiempo como el volumen de muestra necesarios para el análisis. 

 

 Método con PCR.

 

El método estándar de PCR en tiempo real fue más sensible (93%) que el método de cultivo de placa.

 

Además, el método PCR DI-Check Legionella pneumophila proporciona el beneficio de un tiempo de respuesta rápido y una alta sensibilidad, lo que podría reducir aún más el tiempo hasta los resultados, así como reducir el número de análisis de placas que se necesitan, si los cultivos de placas se llevan a cabo solo cuando los resultados de RT-PCR son positivos.

 

Además, se demuestra que, con la misma muestra de agua se puede utilizar tanto para RT-PCR como para cultivos de placa, lo que ahorra tiempo y volumen de muestreo.

 

En conclusión, tanto Legiolert como el método PCR DI-Check Legionella pneumophila son métodos fiables que complementan el método de cultivo de placa para la detección de Legionella pneumophila en muestras de agua destinadas al consumo humano.

 

Sin embargo, se sabe que L. pneumophila es la especie predominante responsable de la propagación ambiental en Europa, y particularmente en Italia y España, que tienen una de las mayores tasas de incidencias de Legionelosis y donde L. pneumophila es responsable prácticamente del 100 % de los casos diagnosticados. 

 

Por esta razón, aunque los datos epidemiológicos pueden estar sesgados por el uso habitual de métodos de diagnóstico clínico que detectan específicamente a L. pneumophila SG1, este estudio se centró en L. pneumophila.

 

En España, el Real Decreto 3/2023, de 10 de enero, por el que se establecen los criterios técnico-sanitarios de la calidad del agua de consumo, su control y suministro también incluye esta exigencia, pero con un valor paramétrico > 100 ufc/L.

 

La norma permite utilizar como complemento al cultivo otros métodos de análisis como el descrito en la UNE-ISO/TS 12869 Calidad del agua. Detección y cuantificación de Legionella spp. y/o Legionella pneumophila por concentración y amplificación génica por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR).
Estos métodos deberán estar validados y documentados en base a la Norma UNE-EN ISO/IEC 17025.

 

Además, afirma que Cuando supere el valor paramétrico se deberá identificar si es Legionella pneumophila y su serogrupo. 

 

Dado que Legiolert y PCR DI-Check solo son capaces de detectar Legionella pneumophila, la utilidad de estos métodos en España está limitada ya que el Real Decreto exige la determinación de Legionella spp.